帕金森病( Parkinson’s disease，PD) 是一種常見于中老 年人的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其主要有兩大病理特征，其一是 以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元及其他含色素的神經(jīng)元大量變性丟 失，尤其是黑質(zhì)致密區(qū)多巴胺能神經(jīng)元丟失最嚴(yán)重; 其二是 在殘存的神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性包涵體，即路易小體 ( Lewy body) 。目前 PD 的確切病因和發(fā)病機(jī)制仍未完全明 了，認(rèn)為是多因素交叉作用下發(fā)病，遺傳易感性增加患病幾 率，在環(huán)境因素、神經(jīng)系統(tǒng)老化等因素共同作用下，通過氧 化應(yīng)激、線粒體功能紊亂、蛋白酶體功能障礙、炎癥和( 或) 免疫反應(yīng)、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、興奮性毒性、細(xì)胞凋亡等機(jī)制導(dǎo)致 黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元大量變性、丟失，才會(huì)發(fā)病。近年 來(lái)發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激( EＲS) 介導(dǎo)的凋亡在 PD 的發(fā)病機(jī)制中 有重大作用。

1 材料與方法

1． 1 實(shí)驗(yàn)材料

1． 1． 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為 SPF 級(jí)雄性 SD 大鼠，體質(zhì) 量 200 ～ 250 g 之間，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供， 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號(hào): SCXX( 遼) 2015 － 0001。大鼠飼養(yǎng)于 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，使用許可證號(hào): SYXK( 遼) 2013 － 0009。飼養(yǎng)溫度 18 ～ 22 ℃，相對(duì)濕度: 40% ～ 70% 。

1． 1． 2 實(shí)驗(yàn)藥品

獨(dú)活飲片、獨(dú)活顆粒劑、獨(dú)活復(fù)方顆粒 劑、塞來(lái)昔布膠囊、美多芭片購(gòu)自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 藥局，獨(dú)活香豆素由沈陽(yáng)藥科大學(xué)提取，獨(dú)活復(fù)方源自唐代 孫思邈《備急千金藥方·風(fēng)懿》獨(dú)活湯。

1． 1． 3 實(shí)驗(yàn)試劑

Lactacystin、阿撲嗎啡，購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司; TriZol( 批號(hào) 14105) ，購(gòu)自 Invirogen 公司; 逆轉(zhuǎn)錄試劑 盒( 批號(hào) 0051509) ，購(gòu)自 New England Biolabs; 擴(kuò)增試劑盒 ( 批號(hào) 0006231745) ，購(gòu)自 Agilent; 蛋白質(zhì)裂解液、一抗稀釋 液、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所; 蛋白 測(cè)定試劑盒，購(gòu)自鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司; 兔抗人 β － Actin 多克隆抗體，購(gòu)自 Santa Cruz; 羊抗兔 HＲP － IgG，購(gòu)自 Santa Cruz; anti － CHOP、anti － Caspase12，購(gòu)自 cell signal 公司。

1． 1． 4 儀器設(shè)備

全自動(dòng)腦立體定位儀，德國(guó) Neurostar stereodrive 生產(chǎn); 多功能酶標(biāo)儀( TriStar2 LB 942 型) ，德國(guó) 伯托生產(chǎn); 水浴恒溫振蕩器( 其林貝爾SHZ-88 型) ，其林貝爾公司 生產(chǎn); 臺(tái)式多功能冷凍高速離心機(jī)，德國(guó)賽默飛生產(chǎn); 垂直 板電泳裝置( Mini － Protean tetra 型) ，美國(guó) Bio － Ｒad 公司 生產(chǎn); 半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀( Trans － Blot SD 型) ，美國(guó) Bio － Ｒad 公 司生產(chǎn); 全自動(dòng)熒光與可見光凝膠成像分析系統(tǒng)( F3 型) ， 英國(guó) Syngene 公司生產(chǎn)。

1． 2 方法

1． 2． 1 模型制備及分組

采用腦黑質(zhì)致密部注射 Lactacystin 的方法復(fù)制 PD 大鼠模型。根據(jù)《大鼠 腦立體定位圖譜》，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，模型復(fù)制大鼠定位 注射 10 μg Lactacystin( 2 μL) ，另設(shè)假手術(shù)組和正常對(duì)照 組，假手術(shù)組定位注射等體積生理鹽水，具體方法請(qǐng)參考。模型復(fù)制后觀察大鼠一般行為學(xué)改變，并于造模后 的第 7、14、21、28 天，進(jìn)行阿撲嗎啡( APO) 檢測(cè)，觀察并記 錄大鼠旋轉(zhuǎn)方向及旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。于最后一次 APO 檢測(cè)后，根 據(jù)大鼠行為學(xué)異常程度，應(yīng)用分層隨機(jī)法，將模型復(fù)制大鼠 分為 7 組: 模型對(duì)照組、吐溫 80 組、獨(dú)活香豆素組、獨(dú)活顆 粒劑組、獨(dú)活復(fù)方顆粒劑組、塞來(lái)昔布組、美多芭組。

1． 2． 2 藥物干預(yù)

各組大鼠給藥劑量按照人與大鼠劑量 換算公式進(jìn)行計(jì)算，獨(dú)活香豆素、獨(dú)活顆粒劑及獨(dú)活復(fù)方顆 粒劑均以含生藥劑量為準(zhǔn)，獨(dú)活香豆素、獨(dú)活顆粒劑依據(jù)前 期研究予常規(guī)劑量的 3 倍量。即獨(dú)活香豆素組: 3 g· kg － 1 ·d － 1 ; 獨(dú)活顆粒劑組: 3 g·kg － 1 ·d － 1 ; 獨(dú)活復(fù)方顆粒 劑組: 6． 3 g·kg － 1 ·d － 1 ; 塞萊昔布組: 20 mg·kg － 1 ·d － 1 ; 美多芭組: 25 mg·kg － 1 ·d － 1 ; 吐溫 80 組: 0． 08% 吐溫 801 mL·100 g － 1 ·d － 1 ; 正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、假手術(shù)組: 等 體積生理鹽水。除獨(dú)活香豆素用 0． 08% 吐溫 80 助溶外， 其余藥物均用生理鹽水配制，體積相同。給藥時(shí)間上午 8 ∶ 00 － 10 ∶ 00，日 1 次灌胃。每周稱體質(zhì)量 1 次，根據(jù)大鼠體 質(zhì)量每周調(diào)整藥物劑量( 體積) ，連續(xù)給藥 10 周。

1． 2． 3 行為學(xué)檢測(cè)

給藥后觀察各組大鼠是否出現(xiàn)一般 行為學(xué)異常; 并于給藥后的第 14、28、42、56、70 天，進(jìn)行 APO 檢測(cè)，觀察大鼠旋轉(zhuǎn)行為、旋轉(zhuǎn)方向及旋轉(zhuǎn)圈數(shù)并記 錄。

1． 2． 4 指標(biāo)檢測(cè)

大鼠于最后一次 APO 檢測(cè)后的次日， 每組隨機(jī)選取 6 只大鼠，過度麻醉處死，斷頭，取左側(cè)腦黑 質(zhì)，分別采用 ＲT － PCＲ( 每組 3 例) 、Western － blot 法( 每組 3 例) ，對(duì)大鼠腦黑質(zhì) CHOP、Caspase12 mＲNA 和蛋白表達(dá) 水平進(jìn)行檢測(cè)。 ( 1) ＲT － PCＲ 檢測(cè): 采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCＲ 法，對(duì)各 組大鼠腦黑質(zhì)中 CHOP、Caspase12 mＲNA 的表達(dá)水平進(jìn)行 檢測(cè)。取新鮮的腦黑質(zhì)組織 100 mg，按照 TriZol 說(shuō)明書提 取總 ＲNA。取 1μg 的總 ＲNA，用 ProtoScript II First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。cDNA 稀釋 4 倍后，用于實(shí)時(shí)熒光定量 PCＲ 檢測(cè)。熒光定量 PCＲ 使用 Brilliant II SYBＲ Green QPCＲ Master Mix 試劑盒。PCＲ 反 應(yīng)條件: 94 ℃，5 min; 40 × ( 94 ℃，20 s; 59 ℃，20 s; 72 ℃，30 s) 。引物序列見表 1，GAPDH 作為內(nèi)參對(duì)照，基因的相對(duì) 表達(dá)量用 2 － △△Ct 法計(jì)算。

( 2) Western － blot 檢測(cè): 采用 western － blot 法檢測(cè)各組 大鼠腦黑質(zhì)組織中 CHOP、Caspase12 的表達(dá)水平。采用細(xì) 胞裂解液裂解法提取黑質(zhì)組織中總蛋白，并測(cè)定蛋白濃度， 加入上樣緩沖液煮沸變性后，以 50 μg /孔的總蛋白量進(jìn)行 垂直電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜，封閉液封閉 1 h， 一抗( 1 ∶ 500) 4 ℃孵育過夜，洗膜后，二抗( 1 ∶ 1500) 室溫孵 育 2 h，洗膜后，將 PVDF 膜置于凝膠成像分析系統(tǒng)中，滴加 ECL 工作液，采集圖像，并測(cè)定目的蛋白及內(nèi)參蛋白條帶灰 度值，并以目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值的比值作為該 樣本中目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1． 2． 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用 SPSS 19． 0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行 數(shù)據(jù)分析處理。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用 x 珋± s 表示，組間比較 采用單因素方差分析，以P ＜ 0. 05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

模型復(fù)制后，大鼠逐漸出現(xiàn) 食欲下降，自主活動(dòng)減少，隨著時(shí)間推移，多數(shù)大鼠相繼出 現(xiàn)運(yùn)動(dòng)遲緩、震顫、對(duì)外界刺激反應(yīng)下降、不自主豎毛、尾僵 等行為學(xué)改變。給予干預(yù)因素后，獨(dú)活香豆素組、獨(dú)活顆粒 劑組、獨(dú)活復(fù)方顆粒劑組、塞來(lái)昔布組和美多芭組大鼠上述 癥狀均明顯改善; 模型對(duì)照組和吐溫 80 組大鼠癥狀無(wú)明顯 改善; 假手術(shù)組和正常對(duì)照組在干預(yù)前后如常，未發(fā)現(xiàn)其行為學(xué)異常。模型復(fù)制大鼠腹腔 注射 APO 后，多數(shù)大鼠出現(xiàn)不同程度的旋轉(zhuǎn)行為，表現(xiàn)為 身體彎曲，甚則首尾相接旋轉(zhuǎn)。分組予以藥物干預(yù)后，獨(dú)活 香豆素組、獨(dú)活顆粒劑組、獨(dú)活復(fù)方顆粒劑組、塞來(lái)昔布組、 美多芭組大鼠旋轉(zhuǎn)行為均較模型對(duì)照組和吐溫 80 組有明 顯改善，但以獨(dú)活香豆素組改善最明顯。

3 討論

獨(dú)活始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》被列為上品，并有“久服輕身耐老”的記載。如今的《中藥學(xué)》教材將獨(dú)活列為祛風(fēng) 寒濕藥之首，辛、苦，微溫，歸腎、膀胱經(jīng)，具有祛風(fēng)濕，止痛， 解表的功效。綜觀中醫(yī)歷代文獻(xiàn)記載，我們發(fā)現(xiàn)，獨(dú)活還具 有調(diào)補(bǔ)五臟，尤善補(bǔ)腎，祛瘀化痰，宣通腦絡(luò)之功，是一味入 陰而升陽(yáng)，通補(bǔ)并用的良藥。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，獨(dú)活 中含有 29 種香豆素，具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、鈣拮抗、調(diào)控凋 亡、抗自由基、抗心律失常、擴(kuò)冠、降壓、抗血小板聚集和血 栓形成、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、催眠、抗腫瘤、保肝、解痙、抗胃潰瘍等 作用。我們?cè)?jīng)對(duì)獨(dú)活、獨(dú)活醇提物及獨(dú)活香豆素延緩模 型鼠腦老化、癡呆、阿爾茨海默病( AD) 的研究，發(fā)現(xiàn)獨(dú)活參 與了多種抗衰老機(jī)制的調(diào)節(jié)。近年來(lái)我們研究發(fā)現(xiàn)， 獨(dú)活香豆素能夠改善 PD 模型大鼠行為學(xué)異常，抗氧化應(yīng) 激、增強(qiáng)抗氧化能力、減少興奮性氨基酸 Glu 的異常增多、 降低血清炎癥因子的含量，對(duì)抗 PD 損傷。目前的一 些研究顯示，獨(dú)活及其有效成分的作用已從傳統(tǒng)的對(duì)風(fēng)寒 濕痹傳統(tǒng)疾病的治療，拓展到抗腫瘤、保肝、對(duì)抗心血管系 統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、骨性相關(guān)疾病及多發(fā)性硬化等疾病的治療。 然而關(guān)于獨(dú)活及其有效成分對(duì) PD 的神經(jīng)保護(hù)作用與內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)應(yīng)激( EＲS) 的關(guān)系研究尚未見到報(bào)道。



 

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